点击图片查看原图 四川传统洗澡泡菜是餐饮行业中常用的一种特殊泡 菜。其做法是将白萝卜(卷心菜、红皮萝卜等)刀工成型后采用食盐干腌, 脱掉多余水分, 放入泡菜坛, 倒入复配的泡菜水, 泡制 2~3 d 而成。蔬菜在微生物的作用下进行微发酵, 其特殊的咸酸味以及爽脆口感的形成与坛中微生物菌群结构等因素密切相关，本实验旨在优化低钠咸味剂制备四川传统洗澡泡菜的最佳工艺配方以及四川传统洗澡泡菜菌落结构、风味特征, 了解低钠咸味剂对四川传统洗澡泡 菜菌落结构、风味特征的影响, 为低钠咸味剂在四川传统洗澡泡菜中的应用提供数据支持。
参考文献：肖岚,廖佑琴,王新程等.低盐洗澡泡菜菌落结构及其风味研究[J].食品安全质量检测学报,2023,14(10):22-30.DOI:10.19812/j.cnki.jfsq11-5956/ts.2023.10.012. 材料与方法
材料
低钠咸味剂(天津春发生物科技有限公司); 花椒、白萝卜(四川省成都龙泉永辉超市); 广乐野山椒(四川广乐食品有限公司); 白砂糖(福建好日子食品有限公司); 白醋(千千味业股份有限公司); 二锅头(北京顺心农业股份有限公司牛栏山酒厂); 食盐(四川久大制盐有限公司)。DNA 提取试剂盒(南京集思慧远生物科技有限公司);MiSeq Reagent Kit V3 基因测序试剂盒(美国 Illumina 圣地亚哥公司)。
低钠咸味剂(天津春发生物科技有限公司); 花椒、白萝卜(四川省成都龙泉永辉超市); 广乐野山椒(四川广乐食品有限公司); 白砂糖(福建好日子食品有限公司); 白醋(千千味业股份有限公司); 二锅头(北京顺心农业股份有限公司牛栏山酒厂); 食盐(四川久大制盐有限公司)。DNA 提取试剂盒(南京集思慧远生物科技有限公司);MiSeq Reagent Kit V3 基因测序试剂盒(美国 Illumina 圣地亚哥公司)。
仪器
FlavourSpec@风味分析仪(德国 G.A.S 公司); α-ASTREE电子舌(法国 Alpha MOS 公司); MiSeq 测序仪(美国 Illumina圣地亚哥公司); ML204 万分之一天平(瑞士梅特勒-托利多国际贸易有限公司); GZ-150-S 型生化培养箱(韶关市广智科技有限公司); MXT-5 (15 m×0.53 mm, 0.5 μm)色谱柱(美国 RESTEK 公司); KQ5200E 超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)。
方 法
洗澡泡菜的制备
在前期的单因素实验中发现低钠咸味剂替代率、泡制温度、泡制时间 3 个因素对洗澡泡菜风味的影响较大, 在此基础上, 设计了 3 因素 3 水平的正交实验, 以感官评分为依据, 筛选出评分最高的 3 个处理组, 进一步优化其工艺配方。
(1)工艺流程
原料预处理→干腌→脱盐→装入泡菜坛→倒入复配的泡菜水→恒温泡制。
(2)工艺要点
原料预处理: 将白萝卜去皮, 切成半径长 3 cm, 厚0.5 cm 的扇形薄片。干腌: 称取 500 g 的白萝卜用 30 g 食盐干腌 15 min。脱盐: 洗去白萝卜上多余食盐, 沥干。
泡菜水的配制: 纯净水 800 g、野山椒 35 g、野山椒水 20 mL、味精 5 g、白糖 40 g、花椒 2 g、白酒 15 g、白醋 25 g, 低钠咸味剂替代量见表 1, 搅拌均匀后倒入泡菜坛, 泡菜水淹没白萝卜。
表 1 样品处理条件表
注 : 对照组食盐含量 5.38%,
DNA 提取及 16S rDNA 分析
提取洗澡泡菜中微生物的总DNA, 对微生物 DNA 的浓度、纯度以及完整度进行检测和扩增测序, 用特定引物对微生物的16S V4~V5 区域进行扩增, 得到的增序片段采用 Illumina Novaseq6000 测序, 测序得到的序列进行 16S rDNA 分析。
提取洗澡泡菜中微生物的总DNA, 对微生物 DNA 的浓度、纯度以及完整度进行检测和扩增测序, 用特定引物对微生物的16S V4~V5 区域进行扩增, 得到的增序片段采用 Illumina Novaseq6000 测序, 测序得到的序列进行 16S rDNA 分析。
洗澡泡菜气相色谱-离子迁移色谱测定
对阳性对照组(四川传统洗澡泡菜)和低钠咸味剂处理组进行气相色谱-离子迁移色谱法(gas chromatography-ion mobility spectrometry, GC-IMS)检测。取 4.00 g 样品置于 20 mL 顶空瓶, 自动顶空进样(进样针温度 80℃、孵育温度 60℃、孵化转速 500 r/min), 选择 GC-IMS 单元[色谱柱型号为 MXT-5 (15 m×0.53 mm,0.5 μm)、柱温 60℃、载气 N2、漂移管温度 45℃、进样体积 500 μL、孵育时间 20 min], 运行 30 min。
洗澡泡菜电子舌检测
取 10 g 洗澡泡菜, 制备 20 mL 研磨液, 将研磨液移入100 mL 容量瓶定容到 100 mL, 用超声波浸提 30 min 后,取 80 mL 上清液移至专用烧杯进行电子舌检测。
取 10 g 洗澡泡菜, 制备 20 mL 研磨液, 将研磨液移入100 mL 容量瓶定容到 100 mL, 用超声波浸提 30 min 后,取 80 mL 上清液移至专用烧杯进行电子舌检测。
结果与分析
洗澡泡菜中细菌和真菌的 Alpha 多样性分析
洗澡泡菜中细菌的 Alpha 多样性分析
本研究的对照组与 3 个处理组的 Goods coverage 指数接近于 1(或等于 1), 说明测序深度已经基本覆盖到样品中所有的物种, 本研究数据有效。Alpha 多样性主要是指样本中群落的多样性, Observed features 指数和 Chao1 指数反映样品中群落的丰富度(species richness), 即指群落中物种的数量, 数值越大物种数越多。表 2 可知, JY2 的 Chao1 值(107.50)、Observed features 值(105.00)最高, 故 JY2 的细菌物种最丰富, JY1、JY3 的 Chao1 值、Observed features 值均最低, 故其细菌物种最少。其原因可能是适当的食盐浓度、泡制温度有利于细菌菌落在 JY2 中大量繁殖, 使其细菌物种最为丰富; 高浓度的食盐、过低或过高的泡制温度抑制了细菌菌落在 JY1 和 JY3 中生长繁殖, 导致 JY1 和JY3 的细菌物种数最少。结果提示低钠咸味剂替代率、泡制温度会影响细菌菌落的生长, 导致洗澡泡菜内细菌群落结构发生改变。Simpson 指数反映了物种分配均匀性和多样性, 从表 2 可知, 除 JY2 的 Simpson 指数以外, JY1 的Simpson 指数与对照组一致(均为 0.89), JY3 的 Simpson 指数(0.90)大于对照组, 进一步说明了低钠咸味剂替代率、泡制温度对洗澡泡菜中细菌的多样性存在影响。
表 2 样品中细菌 Alpha 多样性指数和种群丰富度
洗澡泡菜中真菌的 Alpha 多样性分析
由表 3 可知, 各组的 Simpson 指数均接近 1, 说明其均匀度高; Goods coverage 的值均接近 1, 说明测序深度都基本覆盖了所有物种, 本次实验是有效的。真菌的 Chao1指数和 Observed features 指数都高于细菌, 说明洗澡泡菜中的真菌物种数目较细菌丰富, JY2 的 Chao1 值(507.4)和Observed features (503)值最高, 说明 JY2 的真菌物种数最多, JY3 的 Chao1 值(260.0)和 Observed features (260)值最低,故 JY3 的真菌物种数最少, JY1 和对照组的 Chao1 值和Observed features 值最接近, 故 JY1 与对照组的真菌物种数最为相近。综上, JY1 在真菌物种的丰富度、分配均匀度以及物种的多样性程度与对照组的相似度最高。
表 3 样品中真菌 Alpha 多样性指数和种群丰富度
表 3 样品中真菌 Alpha 多样性指数和种群丰富度
洗澡泡菜中真菌和细菌的物种注释
洗澡泡菜中细菌的物种注释
对相对丰度前 20 的物种进行聚类分析, 如图 1 所示,细菌菌群在属水平上相对丰度最高的是乳杆菌属, 对照组与 3 个处理组的相对丰度均达 51%以上, 其中 JY2 乳杆菌属含量最高(68.92%), 其次是 JY1 (53.72%)、JY3 (51.67%), 对照组含量最低(51.60%), 乳杆菌属是泡菜的优势菌群。JY2 的高乳杆菌属含量与其适宜的低钠咸味剂替代率30%(食盐含量)有关, 即适宜的食盐浓度有利于乳杆菌属的生长。乳杆菌属含量的高低与泡菜风味的形成息息相关, 泡菜中乳杆菌属利用糖类、蛋白质、有机酸、氨基酸产生挥发性物质, 赋予泡菜特殊风味。明串珠菌属在泡菜泡制过程中利用葡萄糖进行异性乳酸发酵产生甘露醇,赋予泡菜清爽的甜味。JY3 中明串珠菌属相对丰度最高(21.19%), 其次是对照组(7.83%)、JY1 (4.03%), JY2 最低(2.80%)。根据韩亚楠等[20]研究发现, 明串珠菌的最适生长温度是 32~38℃, 且具有较强的耐盐性, 其原因可能与明串珠菌属具有耐高盐和喜高温的特性有关, 故对照组和JY3 中明串珠菌属的相对丰度高于 JY1 和 JY2。其他各类细菌菌属的相对丰度在各组洗澡泡菜中均不超过 1%。一方面是乳酸杆菌属成为优势菌后对其他微生物生长的抑制作用,另外可能是食盐浓度、泡制温度不适于其他细菌菌属生长,如普雷沃泰勒菌属(Prevotella)生长的最适温度为 37℃且在盐浓度过高的环境下难以生存, 但其能利用葡萄糖发酵产生乙酸和琥珀酸以及少量的乳酸, 丰富泡菜风味。
图 1 细菌属水平前 20 名相对丰度柱状图
洗澡泡菜中真菌的物种注释
由图 2 可知, 除未分类真菌外, 对照组中漆斑霉菌属(Myrothecium, 4.91%)相对丰度最高, 漆斑霉菌属的适宜生长温度为 28℃且嗜盐, 此外, 漆斑霉属产生的漆酶有利于洗澡泡菜中醛类、醇类、酯类等挥发性香气物质的形成。3 个处理组中毛壳菌(Chaetomium)相对丰度均是最高; JY1中含有脉孢菌(Neurospora, 3.74%)、赤霉菌(Gibberella,3.45%); JY2 中含有赤霉菌(Gibberella, 28.57%)、脉孢菌(Neurospora, 4.96%); JY3 中含有赤霉菌 (Gibberella,3.08%)、被孢霉(Mortieralla, 1.63%)。综上, 3 个处理组中毛壳菌(Chaetomium)为第一优势真菌属, 其中, JY2 的相对丰度最高(37.80%), JY1 次之(5.72%), JY3 最少(5.62%)。姜成研究发现, 毛壳菌生长繁殖的适宜温度应低于 25℃且食盐含量过多会抑制其生长, 由此推测 JY2 中毛壳菌属相对丰度最高的原因是其泡制温度(25℃)适宜且食盐含量最低(28 g), JY3 中毛壳菌属相对丰度最低是因为其泡制温度稍高(30℃)且食盐含量较高(36 g)。毛壳菌能供给泡菜泡制过程所需的酶类, 乳酸在酶的作用下生成乳酸乙酯, 形成泡菜的特殊风味。
图 2 洗澡泡菜真菌在属水平物种分类热图
洗澡泡菜中细菌和真菌 β 多样性分析
洗澡泡菜中细菌 β 多样性分析
Bray curtis 距离常用来反映群落之间差异性, Braycurtis 数值越小, 菌落结构相似度越高, 见图 3。对照组与JY3 的 Bray curtis 值最小(0.391), 与 JY2 最大(0.948), 故JY3在细菌菌落结构上与对照组相似度最高, JY2与对照组差异最大。欧雪等报道在含盐量较高的泡菜组别中, 食盐对菌落的影响不显著, 故推测 JY3 与对照组在细菌结构上相似的原因是JY3食盐含量(36 g)与对照组(40 g)最接近;而 JY2 食盐含量(28 g)与对照组差异较大, 这与吕家樑等研究结果一致, 提示食盐含量的变化对泡菜菌落结构影响较大。本研究中, JY2 泡制温度(25℃)同对照组相同, JY3泡制温度 30℃, 但 JY3 在细菌菌落结构上与对照组相似度最高, 由此推测 5℃的泡制温度差异可能对泡菜菌落结构影响不大。
图 3 洗澡泡菜中的细菌 β 多样性距离热图
洗澡泡菜真菌 β 多样性分析
由图 4 可知, 对照组与 JY1 的 Bray curtis 值最小(0.148), 与 JY3 最大(0.263), 即 JY1 在真菌菌落结构上与对照组相似度最高, JY3 与对照组差异最大, 这与 2.2.2 的研究结果一致。
图 4 洗澡泡菜中的真菌 β 多样性距离热图
洗澡泡菜挥发性风味物质的分析
洗澡泡菜中挥发性化合物的分析
洗澡泡菜的挥发性风味物质主要由两部分组成: 一部分来自萝卜、香辛料、调味料本身气味, 另一部分是萝卜经过微生物发酵产生的挥发性物质。由表 4 可知, 对照组与 3 个处理组中共检出 55 种挥发性物质, 其中酚类 5种、醇类 12 种、酯类 12 种、酮类 8 种、醛类 3 种、酸类3 种、吡嗪类 2 种、烃类 4 种、醚类 1 种、杂环类 4 种、含氮化合物 1 种。汤艳燕等[28]采用 GC-MS 检测了四川传统泡萝卜中的挥发性物质, 共检出 39 种, 其中酯类 8 种、烷烃类 7 种、醛类 4 种、醇类 3 种、芳烃类 2 种, 硫类、烯烃类、酮类、酚类、醚类各 1 种。洗澡泡菜中检出的挥发性物质较传统泡菜多出 16 种, 特别是对泡菜风味贡献较大的醇类、酯类。这是可能是因为传统泡萝卜泡制使用的食盐量多, 其微生物数量减少, 风味物质减少。JY3检出挥发性物质最多(53 种), 其次是 JY2 (44 种)、对照组(44 种), JY1 最少(41 种), 对照组与 JY2 在检出挥发性物质种类数上最接近。挥发性风味物质与泡菜中微生物密切相关, 2.1.1(细菌 Alpha 多样性分析)中 JY2 的细菌物种最丰富, JY1、JY3 最少; 2.2.1(细菌的物种注释)中 JY2 乳杆菌属含量最高, 对照组含量最低。细菌物种丰富、乳杆菌属含量高, 挥发性风味物质种类应越多, 但 JY3 检出挥发性物质种类是最多的, 这可能与菌群中产挥发性物质的菌种种类及数量有关, 也可能与菌群处于的生长阶段有关。对照组与 3 个处理组中均检出的挥发性物质有 38 种, 与对照组比较, 检出相同挥发性物质种类最多的是 JY1 (41 种),这可能与 JY1 的乳杆菌属含量与明串珠菌属含量与对照组相似度最高有关, 这与 YANG 等[32]的研究一致。
洗澡泡菜 GC-IMS 指纹图谱分析
表 4 洗澡泡菜中的挥发性化合物
如图 5 所示, 每列亮点均表示同一保留时间及漂移时间的挥发性化合物的信号峰, 亮点的颜色与范围代表挥发性化合物含量, 颜色越深、范围越大, 表明该挥发性化合物的相对含量越高。由图 5 可知, 对照组与 3 个处理组在特征风味物质上的差异较大, 对照组的特征风味物质是 2-呋喃乙醇; JY1 是丁酸己酯、2-辛酮; JY2 是乙酸丁酯、2-甲基丁酸甲酯、苯乙烯、异戊酸; JY3 是 3-仲丁基-2-甲氧基吡嗪、崁醇、芳樟醇、甲基麦芽酚、苯乙酮、罗勒烯、2,6-二氯酚、松油烯-4-醇、2,4-二氯苯酚。唐丽等报道四川传统泡菜的特征风味物质是乙酸、丁酸、乙酸乙酯和 2-乙基-1-己醇, 与对照组和 3 个处理组均不同, 因其是传统发酵泡菜, 且使用成熟泡菜的发酵液进行泡制, 泡制时间较长(5 个月), 故其特征风味物质与本实验样品组差异较大。2.3(细菌和真菌 β 多样性分析)中 JY2 在细菌菌落结构上与对照组差异最大; JY3 在真菌菌落结构上与对照组差异最大。菌落结构的差异会影响特征风味物质的种类。图5 可知, JY3 中的醇类物质、酚类物质较对照组高, 可能与JY3 中的明串珠菌含量高有关[34]; JY2 中乳杆菌属的含量最高, 乳杆菌有利于乳酸、乙酸、酯类等风味物质生成,可进一步形成乙酸丁酯。
图 5 洗澡泡菜中挥发性化合物的指纹图谱
洗澡泡菜电子舌分析
判别因子分析(discriminant factorial analysis, DFA)是将电子舌的数据重新组合, 缩小组内的变量差距, 并且扩大组间的变量差距, 从而达到区分各种样品的目的的一种分析方法。将电子舌采集到的响应值数据进行 DFA 分析,由图 6 可知前 2 个判别因子的贡献率分别为 79.804%、19.191%, 累计贡献率达到 98.994%(超过 95%), 说明 2 种主成分包括了对照组和各个处理组的绝大部分的信息。在三维图中, 组内的每个数据点之间的距离很小, 可以很好地聚集在一起, 各组之间数据点非常明显地分布在三维图的各个角落, 由此可以判定, 电子舌能识别出不同处理组洗澡泡菜。JY1 与对照组距离最近, JY3 与对照组距离最远,说明 JY1 与对照组在滋味上的相似度最高, JY3 与对照组差异最大, 这与低钠咸味剂替代率、泡制温度有关。低钠咸味剂中含有美拉德反应咸味肽、非钠型咸味物质、果蔬粉或果蔬提取物、酸味粉末物质和鲜味物质, 能提供咸味、酸味、鲜味, 对泡菜滋味影响较大。JY3 的低钠咸味剂替代率(10%)最少, 但其泡制温度最高30℃), JY1 的低钠咸味剂替代率为 20%, 但泡制温度最低(20℃), 在相同的泡制时间下, 温度越低, 食盐、低钠咸味剂扩散进入萝卜的速度越慢, 故 JY1 与对照组在滋味上的相似度最高。
结 论
与传统洗澡泡菜的菌落结构、风味差异最小的低盐洗澡泡菜是JY1, 即低盐洗澡泡菜的最佳工艺配方是泡制温度20℃,泡制时间 48 h, 低钠咸味剂替代量 20%(食盐用量 32 g)。
四川传统洗澡泡菜的优势菌属为乳杆菌属、明串珠菌属、漆斑霉菌属, 低盐洗澡泡菜(3 个处理组)的优势菌属为乳杆菌属、明串珠菌属、毛壳菌属。洗澡泡菜中的真菌物种数目比细菌多, JY2 中真菌物种数、细菌物种数均最丰富。JY3 在细菌菌落结构上与对照组相似度最高, JY2 与对照组差异最大。JY1 在真菌菌落结构上与对照组相似度最高, JY3 与对照组差异最大。可见, 低钠咸味剂对洗澡泡菜菌落结构存在一定影响。
图 6 洗澡泡菜电子舌判别因子分析三维图
结 论
与传统洗澡泡菜的菌落结构、风味差异最小的低盐洗澡泡菜是JY1, 即低盐洗澡泡菜的最佳工艺配方是泡制温度20℃,泡制时间 48 h, 低钠咸味剂替代量 20%(食盐用量 32 g)。
四川传统洗澡泡菜的优势菌属为乳杆菌属、明串珠菌属、漆斑霉菌属, 低盐洗澡泡菜(3 个处理组)的优势菌属为乳杆菌属、明串珠菌属、毛壳菌属。洗澡泡菜中的真菌物种数目比细菌多, JY2 中真菌物种数、细菌物种数均最丰富。JY3 在细菌菌落结构上与对照组相似度最高, JY2 与对照组差异最大。JY1 在真菌菌落结构上与对照组相似度最高, JY3 与对照组差异最大。可见, 低钠咸味剂对洗澡泡菜菌落结构存在一定影响。
四川传统洗澡泡菜中检出挥发性物质 44 种, 其特征风味物质是 2-呋喃乙醇; JY2 与其在挥发性物质种类上差异最小, JY1 与其共有的挥发性物质最多。JY1 中的特征风味物质是丁酸己酯、2-辛酮; JY2 是乙酸丁酯、2-甲基丁酸甲酯、苯乙烯、异戊酸; JY3 是崁醇、芳樟醇、甲基麦芽酚等, 与对照组差异较大。JY1 与对照组在滋味上的相似度最高。综合菌落结构、挥发性物质以及滋味, JY1 与对照组的品质最接近。低钠咸味剂量对洗澡泡菜的风味是有显著影响的, 本研究结果为低钠咸味剂在洗澡泡菜中的使用提供了理论支撑。
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