枳壳为芸香科柑橘属植物酸橙Citrus aurantium L.及其栽培变种的干燥未成熟果实，性微寒，味苦、辛、酸，归脾、胃经；具有理气宽中、行滞消胀的功效[1]，其主产于江西、四川、湖南、湖北、贵州等地[2]，以江西枳壳的质量为最佳，是江西省四大“道地药材”之一[3]。枳壳的化学成分主要有黄酮类、挥发油类、香豆素类、生物碱类、多糖、三萜和其他微量成分[4-5]。枳壳的炮制方法有麸炒、酒炒、醋炒、蜜水炒等，目前《中国药典》2020年版只收载枳壳、麸炒枳壳。枳壳生用辛燥作用较强，偏于行气宽中除胀；经麸炒后可缓和其峻烈之性，偏于理气健胃消食。枳壳经麸炒后，临床应用发生了改变，可见，对中药饮片不同炮制品的准确区分对临床科学合理用药至关重要[6]。
        气味是传统中药经验鉴别的重要特征之一，枳壳经麸炒后，气味由“清香”转向“略有焦香气”，但此描述较为主观、模糊。随着仿生技术的不断发展，电子鼻技术已广泛应用于食品[7-8]、农业[9]、医药[10-12]、环境科学[13]等领域。Heracles NEO超快速气相电子鼻技术基于顶空气相原理，具有使用寿命长、信号稳定、重复性好、分析时间短等优点[6]。
        本研究基于Heracles NEO超快速气相电子鼻技术结合Arochembase数据库比对分析，采用气味指纹图谱、多变量统计分析方法对枳壳麸炒前后气味差异标志物进行快速识别，以期从气味上快速鉴别生、麸炒枳壳饮片，为生、麸炒枳壳饮片的质量控制提供参考。
       1 仪器与材料
       1.1 仪器
        Heracles NEO型超快速气相电子鼻、PAL RSI型全自动顶空进样器、MXT-5非极性毛细管柱、MXT-1701中极性毛细管柱，法国Alpha MOS公司；GA-380N型低噪音空气泵，北京中兴汇利科技发展有限公司；GH-380N型高纯氢气发生器，北京中兴汇利科技发展有限公司；FA1104N型电子分析天平，上海菁海仪器有限公司；BO-400Y型多功能粉碎机，中国永康铂欧五金厂。
       1.2 材料
        12批枳壳样品购于甘肃中天药业有限责任公司，具体样品批次信息见表1，经南京中医药大学药学院陈建伟教授鉴定，确定样品来源为芸香科植物酸橙C. aurantium L.的干燥未成熟果实。         正构烷烃nC6～nC16混合对照品，美国Restek公司，批号A10142930；α-蒎烯对照品，批号110897-202204，质量分数98.4%，购自中国食品药品检验研究院；D-柠檬烯对照品（CAS号7705-14-8，质量分数95%）、β-月桂烯对照品（CAS号123-35-3，质量分数≥90%）购自上海源叶生物科技有限公司。
        2 方法与结果
        2.1 生、麸炒枳壳的炮制
        将12批枳壳药材，按照《中国药典》2020年版一部枳壳项下收载的枳壳、麸炒枳壳饮片炮制方法，分别对应炮制成生枳壳饮片12批（编号R1～R12）、麸炒枳壳饮片12批（编号F1～F12），供实验研究用。
        2.2 对照品溶液的制备
        分别精密量取D-柠檬烯对照品、α-蒎烯对照品、β-月桂烯对照品各1 μL，置20 mL顶空进样瓶中，分别精密加入20 μL正构烷烃nC6～nC16混合标准品溶液，密封，即得对照品溶液。
        2.3 供试品溶液的制备
        取各批次生、麸炒枳壳样品，经打粉后过二号筛，密封冷藏备用。分析时，称取样品粉末1.0 g至20 mL顶空瓶中，以铝制硅胶垫的顶空瓶盖进行钳口密封，备用。
        2.4 生、麸炒枳壳气味检测方法的建立
        为获得良好的分离分析效果，需要对检测条件进行优化，寻找最佳检测条件。选取编号为F12供试品粉末作为样品，对孵化温度、孵化时间、样品用量、进样量等关键影响因素进行单因素考察。
        2.4.1 孵化温度考察 精密称定F12样品0.5 g，在孵化时间20 min，进样量3000 μL的条件下，考察孵化温度60、65、70、75、80 ℃，每个水平平行测定3次。对所得色谱图信息进行分析，发现在75 ℃时，所得色谱峰的信息较丰富，且各色谱峰峰形良好、稳定。因此，选择孵化温度为75 ℃。在孵化温度从60 ℃升至80 ℃的过程中，50～60 s处色谱峰增高较为明显，孵化温度为75 ℃时，平均增幅高于20%。
       2.4.2 孵化时间考察 精密称定F12样品0.5 g，在孵化温度75 ℃，进样量3000 μL的条件下，考察孵化时间5、10、15、20、25 min，每个水平平行测定3次。对所得色谱图信息进行分析，发现随着孵化时间的延长，色谱峰的峰面积逐渐增大。当孵化时间达到10 min时，各色谱峰趋于饱和稳定，因此选择孵化时间为10 min。在孵化时间从5 min增加到25 min的过程中，当孵化时间为10 min及更长时，在50～60 s处色谱峰峰面积增幅均高达500%。
        2.4.3 样品用量考察 在孵化温度75 ℃，孵化时间10 min，进样量3000 μL的条件下，考察样品用量0.7、0.8、0.9、1.0、1.1 g，每个水平平行测定3次。结果分析表明，当样品用量为1.0 g时，所得色谱图信息良好，因此，选择样品用量为1.0 g。
        2.4.4 进样量考察 精密称定F12样品1.0 g，在孵化温度75 ℃，孵化时间10 min的条件下，考察进样量1000、2000、3000、4000、5000 μL，每个水平平行测定3次。对所得色谱图信息进行分析，发现当进样量达到4000 μL后，色谱峰稳定，表明其气味基本趋于饱和，因此，选择进样量为4000 μL。
        2.4.5 检测条件的确定 通过单因素实验的考察，确定生、麸炒枳壳的Heracles NEO检测条件为：样品瓶20 mL；称样量1.0 g；孵化温度75 ℃，孵化时间10 min，孵化炉转速500 r/min，捕集阱初始温度40 ℃，捕集阱最终温度250 ℃，捕集阱分流速率10 mL/min，捕集持续时间26 s，进样口温度200 ℃，检测器温度260 ℃；进样量4000 μL，进样体积流量125 μL/s，进样持续时间21 s，柱温的初始温度50 ℃，柱温程序升温方式4.0 ℃/s至90 ℃、1.0 ℃/s至160 ℃、0.2 ℃/s至165 ℃，保持5 s、2.0 ℃/s至225 ℃、4.0 ℃/s至250 ℃，保持30 s；采集时间150 s；FID增益12。
        2.5 方法学考察
        2.5.1 精密度试验 按“2.3”项下方法制备1批供试品粉末，分别装于6个电子鼻专用顶空进样瓶中，每份称取1.0 g，精密称定，用隔垫密封，放置在自动进样器上，进样分析。结果（表2）表明，11个色谱峰的保留时间和峰面积的RSD最大值分别为0.38%、4.4%，表明仪器精密度良好。         2.5.2 重复性试验 按“2.3”项下方法平行制备6批供试品粉末，装于6个进样瓶中，每份称取1.0 g，精密称定，进样分析。结果（表2）表明，11个色谱峰的保留时间和峰面积的RSD最大值分别为0.35%、4.7%，表明方法重复性较好。
       2.5.3 稳定性试验 按“2.3”项下方法制备1批供试品粉末，分别于0、2、4、8、12、24 h进样分析。结果（表2）表明，11个色谱峰的保留时间和峰面积的RSD最大值分别为0.44%、4.9%，表明样品在24 h内稳定性良好。
       2.6 超快速气相电子鼻检测结果分析
       按“2.4.5”项下的检测条件对生、麸炒枳壳饮片各批次样品进行分析，建立气味指纹图谱。将校正混合物正构烷烃nC6～nC16及对照品置顶空瓶中，以与样品相同的孵育和分析条件进行分析，将生、麸炒枳壳饮片色谱峰的保留时间转化为Kovats保留指数，参照AroChembase数据库对样品中的挥发性成分进行定性分析[6,14]，比较生、麸炒枳壳饮片气味成分变化。以Alpha Soft 17.0（法国Toulouse公司）软件对各样品气味指纹图谱进行多元统计分析，比较各样品差异，寻找差异性气味标志化合物。
      2.6.1 气味指纹图谱的建立 基于Heracles NEO超快速气相电子鼻检测分析结果，以MXT-5色谱柱采集的信号建立生、麸炒枳壳饮片样品气味指纹图谱，结果如图1、2所示。        将生枳壳饮片和麸炒枳壳饮片气味指纹图谱共有模式（由于色谱峰主要集中在前90 s内，故选择前90 s的色谱图）作镜像图，比较两者色谱峰的数目及峰面积变化规律，寻找专属性差异，可直观观察炮制前后的气味量比关系变化情况，结果见图3。由图谱可知，在前10～30 s内，麸炒枳壳相比于生枳壳，色谱峰数目有增加，例如4、6号峰；在50～70 s内，麸炒枳壳相比于生枳壳，色谱峰数目几乎无变化，但色谱峰的峰高下降明显，例如8～10号峰；经计算发现，12批麸炒枳壳饮片中8号峰（β-月桂烯）峰高平均下降54.5%、9号峰（D-柠檬烯）平均下降42.4%，10号峰（γ-松油烯）平均下降46.1%，表明枳壳经麸炒后挥发性成分含量下降明显。与文献“经麸炒后，麦麸皮可以吸收部分挥发油，使挥发油成分降低”论述相一致[15]。        2.6.2 主成分分析（principal component analysis，PCA） PCA是一种无监督的模式识别方法，将数据降维处理提取几个特征值较大且能反映样本信息变量的因子进行线性分类，可在多维空间直观显示样品间的差异，同时也可显示变量之间的分布[11,16]。将超快速气相电子鼻所分离色谱峰作为影响因子，进行PCA，结果见图4。在PCA模型中，第1主成分（PC1）贡献率为99.504%，第2主成分（PC2）贡献率为0.196%，第3主成分（PC3）贡献率为0.185 7%，主成分累积贡献率之和达99.885 7%，能较好地对生、麸炒枳壳饮片进行区分。         2.6.3 判别因子分析（discriminant factor analysis，DFA） DFA是在主成分分析的基础上，根据某些准则建立判别函数，将不同组别样本的差异扩大，使同类样本间差异缩小的一种具有判别分类功能的数据模型，可以用来识别和分类未知样本[11,17]。对生、麸炒枳壳样品的超快速气相电子鼻数据进行判别因子分析，结果如图5所示，横、纵坐标分别表示DFA转换得到的第1区分指数（DF1）和第2区分指数（DF2）。图中DF1的区分指数为100%，说明DFA分析法能够更好地从气味角度区分生、麸炒枳壳样品，且二者距离较远，气味明显改变，差异较大，这也符合实际感官描述。表明气相电子鼻可以快速鉴别生、麸炒枳壳饮片，进一步验证了PCA的分析结果。        2.6.4 生、麸炒枳壳饮片气味差异标志物分析 将生、麸炒枳壳饮片在超快速气相电子鼻色谱柱上采集到的色谱峰与Arochembase数据库进行匹配分析，结果共鉴定出11个主要气味化学成分，其中生枳壳饮片中有9个气味化学成分，与麸炒枳壳相比，缺少甲基叔丁基醚、异戊醇2个成分。生、麸炒枳壳中可能存在的化合物及感官描述信息见表3。进一步分析已鉴定出的可能化合物气味信息发现，β-月桂烯、D-柠檬烯、γ-松油烯、4-异丙烯基甲苯、2-壬基醇具有“桔子、橙、柠檬”的味道，而桔子、橙、柠檬均为芸香科柑橘属植物，果皮均含有丰富的挥发油，β-月桂烯、D-柠檬烯和γ-松油烯为单萜类化合物，是挥发油的组成成分，具有特殊香气，且D-柠檬烯主要存在于柑橘类植物中[18]；本研究用枳壳饮片来源于芸香科柑橘属植物，表明已鉴定出的成分与枳壳含有的成分有较好的一致性。       在得到生、麸炒枳壳饮片气味成分信息的基础上，为进一步分析得出气味差异标志物，以11个气味成分所对应的色谱峰峰面积为变量，采用SIMCA 14.1软件建立生、麸炒枳壳OPLS-DA模型，分析得到11个成分的VIP值，结果见图6。VIP值越大，表明该成分对区分生、麸炒枳壳饮片的贡献越大。由图6可知，对区分生、麸炒枳壳饮片贡献较大的前3个成分是D-柠檬烯、β-月桂烯和γ-松油烯，且这3个成分也是多数学者研究[19-20]有报道的枳壳挥发油组成成分，结合枳壳麸炒前后挥发性成分含量变化情况，初步推测这3个成分为区分生、麸炒枳壳饮片的气味差异标志物。        3 讨论
       中药饮片经炮制后，其色、气、味多会发生改变，真伪优劣的判断多依靠老药工的经验来判断，具有主观性强、传承难度大的缺点[21]。随着科学技术的发展，目前电子眼、电子鼻、电子舌等新型仿生感官技术已逐步应用于中药饮片质量控制方面，将传统经验鉴别进行了客观化表达。
       枳壳为芸香科柑橘属植物的未成熟果实，众所周知，芸香科柑橘属植物所结果实的果皮中含有挥发油，大多数具有清香的气味，且枳壳经麸炒后气味发生变化，转变为“略有焦香气”。本研究基于Heracles NEO超快速气相电子鼻建立了生、麸炒枳壳饮片气味快速检测方法，测定了生、麸炒枳壳饮片气味指纹图谱，指认了11个气味化学成分，其中甲基叔丁基醚和异戊醇为麸炒枳壳饮片中新增加成分；结合OPLS-DA模型中的VIP值及成分变化情况，推测D-柠檬烯、β-月桂烯和γ-松油烯为生、麸炒枳壳气味差异标志物。
       枳壳经麸炒后，其燥性得到缓和，偏于理气健胃消食，生熟异治，更好地满足临床治疗需求。挥发油是枳壳“宽中除胀”的主要活性成分，枳壳经麸炒后，对胃肠道的刺激作用减弱，其含有的成分对胃排空、肠蠕动具有明显的促进作用，能抑制胃肠平滑肌收缩[22-23]，还具有抗炎、抑菌、抗氧化、抗肿瘤等药理作用[20,24-27]。有学者研究发现麸炒的过程中辅料麦麸能与共炒的饮片发生化学变化[28]，存在相互吸附作用[29]。本研究发现，枳壳经麸炒后有成分的新增，已初步鉴定出的甲基叔丁基醚和异戊醇推测可能是麦麸与枳壳在高温炒制过程中发生复杂的化学反应产生的新成分，也有可能是麦麸中的挥发性成分吸附至枳壳。枳壳和麦麸在炒制过程中挥发性成分的组成及含量变化是麸炒枳壳性味及功效发生变化的基础，还需要进一步深入研究麸炒过程中成分变化的规律，同时结合药效学研究，阐明研究麸炒枳壳的炮制机理。
       与传统GC-MS联用技术方法相比，超快速气相电子鼻采用双色谱柱同时进样分析，通过Kovats保留指数对气味成分进行定性分析，具有分析时间短、灵敏度高、样品用量少、无需对样品进行预处理等优点。但基于其检测原理，仪器使用时对环境要求较高，使用过程中要保证环境的稳定；且匹配数据库AroChembase也具有一定局限性，国外在研发仪器时多是针对某一类物质如烃类、醇类[30]，定性分析出来的气味成分专属性、特征性较弱，难以满足气味复杂的中药的需求。但超快速电子鼻作为新兴现代仿生技术，可实现中药饮片的快速检测，有望应用于中药饮片生产过程的在线检测，可极大促进中药饮片产业的发展。
        本研究中生、麸炒枳壳鉴别出的气味成分数量有限，后续研究可结合GC-MS、HS-SPME-GC-MS等多种检测手段，从定性定量角度更加全面分析枳壳麸炒前后各类成分变化情况，以期为研究枳壳麸炒机理及枳壳饮片生产质量在线监测提供参考。
       来 源：中草药杂志社
       参考文献：梅 茜，许金国，苏联麟，毛春芹，陆兔林，房 方．基于Heracles NEO超快速气相电子鼻对枳壳麸炒前后气味差异标志物的快速识别研究 [J]. 中草药, 2023, 54(16):5165-5171.
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